在使用時，我們需要先把目鏡測微尺裝入目鏡筒中，具體操作為：先把目鏡從顯微鏡上拔下來，在遠離鏡片（也就是我們平時觀察時看的地方）的一端有個齒輪狀的圓形結構，把它擰開，然后把目鏡測微尺裝入其中，注意正面要放于視場光闌上，然后將其擰回去，放回目鏡就行了。有的的顯微鏡由于結構精密，不允許拆卸，需專門配有測微尺的目鏡。然后將測微臺尺放于載物臺上，調節顯微鏡焦距知道能看到臺尺清晰的刻度為止。這時調整讓兩尺子的一端在整刻度重合，然后尋找另一端在什么地方重合，數出他們重疊部分的格數就能算出目鏡測微尺在放大情況下的實際倍率了。

        具體計算公式如下：

目鏡測微尺每格=（臺尺重疊數X10）÷目尺重疊格數。如上圖臺尺的重疊格數為4格，目鏡測微尺的重疊格數為10格。由此可以計算出目鏡測微尺每格代表的長度為：（4X10）/10=4um。

        確定好目鏡測微尺每格代表的長度后移開臺尺，之后使用時就能用它確定被檢物實際長度了。由于生物顯微鏡有多個物鏡，每個物鏡放大倍率不同，目鏡測微尺在不同倍率下所代表的實際長度不同，因此在切換倍率時應重新校準。